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Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒 分子生物試劑

  • 更新時(shí)間:  2023-07-27
  • 產(chǎn)品型號:  80234
  • 簡單描述
  • Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
    從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片中同時(shí)純化基因組DNA和總RNA(包括小RNAs)

    使用小樣本量即可獲得大量純化產(chǎn)物
    在純化同時(shí),保持DNA和RNA的完整性
    高效分離RNA和DNA
    對同一FFPE樣本進(jìn)行全面的DNA和RNA分析
詳細(xì)介紹

Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒



如要對基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠比較,則需從同一樣本中純化DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中純化DNA和RNA。純化產(chǎn)物適用于real-time PCR和焦磷酸測序等應(yīng)用。

從FFPE樣本中純化DNA和RNA。

[A] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化基因組DNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對照)進(jìn)行純化,兩種試劑盒都含有RNase消化試劑。采用吸光度測定方法檢測每個20 μm組織切片的DNA產(chǎn)量。[B] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化RNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Tissue Kit(專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對照)進(jìn)行純化。采用吸光度測定方法檢測每個10 μm組織切片的RNA產(chǎn)量。從FFPE組織中純化DNA或RNA時(shí),AllPrep Kit的表現(xiàn)與專用的純化試劑盒表現(xiàn)相當(dāng)。

對預(yù)擴(kuò)增的cDNA進(jìn)行芯片分析。

使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人類乳腺FFPE組織中純化總RNA。然后使用RT2 FFPE PreAMP技術(shù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array,通過real-time PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析,將腫瘤樣本與非腫瘤樣本進(jìn)行對比。ΔΔCT分析顯示:腫瘤樣本中的基因表達(dá)與非腫瘤樣本的基因表達(dá)存在x倍的差異。

對FFPE樣本中的DNA和RNA進(jìn)行可靠擴(kuò)增。

使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或?qū)S糜趶腇FPE樣本中純化DNA或RNA的試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 或RNeasy FFPE Kit,作為對照)從大鼠FFPE組織中純化獲得[A] DNA 和[B]、[C] RNA。在ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System上,使用[A] QuantiTect SYBR® Green PCR Kit對78 bp的Prnp基因擴(kuò)增子進(jìn)行Real-time PCR分析,或是用[B]、[C] QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit對Jun原癌基因表達(dá)進(jìn)行real-time RT-PCR分析。AllPrep Kit和另外兩個專用試劑盒的CT值相當(dāng),表明三種試劑盒純化DNA或RNA的效率相當(dāng)。[C] 此外,在沒有逆轉(zhuǎn)錄酶(–RT)的條件下分析了Jun基因的表達(dá)。脾臟是富含DNA的組織,其擴(kuò)增曲線平坦,說明純化的RNA中不含基因組DNA。

AllPrep DNARNA FFPE樣本純化步驟。


Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒


性能
使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化的DNA和RNA的質(zhì)量與使用QIAamp FFPE Tissue Kit和RNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPE Kit純化的產(chǎn)物的質(zhì)量相當(dāng)。因此,純化產(chǎn)物可用于焦磷酸測序、real-time PCR和RT-PCR等下游應(yīng)用。
原理

AllPrep DNA/RNA FFPE Kit專為從FFPE樣本中同時(shí)純化基因組DNA和總RNA而設(shè)計(jì)。該試劑盒可使用同一樣本純化DNA和RNA,而非像其他純化方法那樣,需將樣本分為兩份再分別進(jìn)行純化操作。如將樣本分為兩份分別純化DNA和RNA,其純化出的DNA和RNA來自不同的細(xì)胞群落,可能具有不同性質(zhì)特征。從同一樣本中同時(shí)純化DNA和RNA可減少浪費(fèi),因?yàn)镕FPE樣本是十分珍貴的樣本,通常很難恢復(fù)且樣本量少。

由于固定和包埋,F(xiàn)FPE樣本中的核酸通常都嚴(yán)重片段化,核酸的分子量通常小于從新鮮或冷凍樣本中分離出的核酸的分子量。從同一FFPE樣本中分離DNA和RNA面臨著很大困難:片段化的DNA長度短,且部分是單鏈結(jié)構(gòu);因此其更像RNA,而非完整的DNA。片段化DNA這一特性使得用物理方法分離DNA和RNA十分困難。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從同一個FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。

盡管標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制分析(如凝膠電泳或芯片分析方法)無法檢測到甲醛的化學(xué)修飾,但其對酶分析有嚴(yán)重干擾。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過優(yōu)化,可zui大程度上逆轉(zhuǎn)甲醛化學(xué)修飾,而不引起DNA和RNA的進(jìn)一步降解。

操作流程
簡單的流程可從同一個樣本中純化高品質(zhì)DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從同一個FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。使用這種方法時(shí),F(xiàn)FPE樣本要在優(yōu)化的裂解緩沖液中孵育,使得RNA釋放出來,而DNA形成沉淀。離心后,將含有RNA的上清和含有DNA的沉淀分別處理,純化RNA和DNA。再次進(jìn)行孵育有一定的解交聯(lián)作用,然后使用RNeasy MinElute或QIAamp MinElute離心柱純化RNA和DNA。用柱上DNA酶處理純化的RNA,以有效去除DNA污染。根據(jù)RNA與離心柱的結(jié)合情況,純化的RNA中可能含有也可能不含miRNA等小RNAs。對于純化后的DNA,可選擇性進(jìn)行柱上RNA酶消化,因?yàn)樵陔x心前的DNA和RNA分離步驟中RNA污染水平已達(dá)到zui低。
應(yīng)用

盡管AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經(jīng)過優(yōu)化,可zui大程度上逆轉(zhuǎn)福爾馬林化學(xué)修飾,而不引起DNA和RNA的進(jìn)一步降解;但從FFPE樣本中純化獲得的核酸不應(yīng)該用于需要大分子量DNA或完整長度RNA的下游應(yīng)用。一些應(yīng)用可能需要進(jìn)行化學(xué)修飾后,再使用片段化核酸(如:設(shè)計(jì)PCR和RT-PCR的小擴(kuò)增子)。在cDNA合成中,應(yīng)使用基因特異性引物,而非oligo-dT引物。如果無法使用基因特異性引物,則可使用任意引物。

特點(diǎn)
參數(shù)
ApplicationsPCR, qPCR, real-time RT-PCR, microarray
Elution volumeRNA: 14-30µl ; DNA: 30-100µl
FormatSpin column
Main sample typeFFPE tissue samples
Number of preps per run50
ProcessingManual (centrifugation)
Purification of total RNA, miRNA, poly A+ mRNA, DNA or proteinRNA (miRNA) and DNA
Sample amountmax. 4*10 µm sections or 2*20 µm sections
TechnologySilica technology
Time per run or per prep6h for 10 samples, including sectioning
YieldVaries




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